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Jul 21, 2023

Implementierung einer neuartigen Einfang- und Ligationssonde

Malaria Journal Band 22, Artikelnummer: 21 (2023) Diesen Artikel zitieren 1375 Zugriffe auf 2 Altmetric Metrics-Details Dem Massenscreening und der Behandlung (MSAT) zur Malariaeliminierung fehlt eine ideale Diagnose

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Dem Massenscreening und der Massenbehandlung (MSAT) zur Malariaeliminierung fehlt ein ideales diagnostisches Instrument, um empfindliche und erschwingliche Tests der Zielpopulation vor Ort zu ermöglichen. In dieser Studie wurde untersucht, ob Capture and Ligation Probe-PCR (CLIP-PCR) in einem Feld-MSAT in Laiza City, Myanmar, eingesetzt werden könnte.

Am Tag 0 wurden von jedem Teilnehmer zwei getrocknete Blutflecken gesammelt. Am ersten Tag wurden alle Proben in einem 20 m² großen Labor mit Werkbank, einem Biosicherheitsschrank, einem Kühlschrank, einem Tischschüttelinkubator und einem qPCR-Gerät von vier Technikern in einer Gesundheitsklinik von auf Plasmodium untersucht die chinesische Grenzstadt Nabang. Am zweiten Tag wurden alle positiven Ergebnisse weiterverfolgt und behandelt.

Von 15.038 untersuchten Personen (65 % der Gesamtbevölkerung) waren 204 (1,36 %) CLIP-PCR-positiv. Unter ihnen waren 188, 14 und 2 mit Plasmodium vivax, Plasmodium falciparum und P. vivax/P infiziert. Falciparum-Mischung bzw. Die Testkapazität betrug 538 Personen/Tag, die Kosten beliefen sich auf 0,92 US-Dollar/Person. Der Anteil der submikroskopischen Infektion betrug 64,7 %. Alle positiven Personen wurden innerhalb von 72 Stunden nach der Blutentnahme behandelt.

Der Einsatz von CLIP-PCR in MSAT in Umgebungen mit geringer Übertragung kann die Bemühungen zur Eliminierung von Malaria in der Grenzregion China-Myanmar unterstützen.

Unter Massenscreening und -behandlung (MSAT) für Malaria versteht man die Untersuchung einer gesamten Bevölkerung in einem weiten geografischen Gebiet, gefolgt von der Behandlung nur positiver Personen, unabhängig davon, ob sie Malariasymptome haben. Ein solcher Ansatz liefert wichtige Informationen zur Epidemiologie der Malaria, die für weitere Bemühungen zur Eindämmung der Krankheit nützlich sein können [1] und von der Zielgruppe eher akzeptiert wird als die Massenverabreichung von Medikamenten [2]. Darüber hinaus könnte eine massenprophylaktische Behandlung mit Primaquin zur Bekämpfung von Plasmodium vivax-Ausbrüchen aufgrund einer hohen Rate an Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase-Mangel (bis zu 14,8 %) in der Bevölkerung des Zielbezirks gefährlich sein [3]. Obwohl die MSAT-Strategie im Zusammenhang mit der Eliminierung von Malaria in jüngster Zeit erneut Beachtung gefunden hat, hat die Weltgesundheitsorganisation (WHO) MSAT nicht als Interventionsstrategie zur Unterbrechung der Malariaübertragung empfohlen, da ein hochempfindliches Diagnosetool mit hohem Durchsatz fehlt das sowohl kostengünstig als auch feldfreundlich zu betreiben ist [2, 4].

Um diese Herausforderung zu meistern, wurde ein molekularer Hochdurchsatztest auf einer 96-Well-Plattenplattform namens Capture and Ligation Probe-PCR (CLIP-PCR) entwickelt [5], der den direkten Malaria-RNA-Nachweis ohne Nukleinsäurereinigung und reverse Transkription ermöglicht. mit einer Nachweisgrenze von 0,01 Malariaparasiten/µL Blut oder etwa 0,33 Parasiten/µL bei Verwendung von 3 mm Trockenblutflecken (DBS) [5, 8]. Dies entspricht der von der WHO empfohlenen Zielnachweisgrenze (2 Parasiten/µL oder weniger) für PCR-basiertes Malaria-Screening in Umgebungen mit geringer Transmission [6] und macht das Malaria-Screening gleichzeitig einfacher und kostengünstiger als Mikroskopie und standardmäßige verschachtelte PCR [7, 8]. Bei dieser Methode werden 18 S-rRNA-Ziele in Blutproben durch Zelllyse freigesetzt und durch eine Reihe spezifischer Sonden mit Schwanz in den Vertiefungen einer 96-Well-Einfangplatte durch Sandwich-Hybridisierung eingefangen. Nach der Entfernung zusätzlicher Sonden und Verunreinigungen werden die gebundenen Sonden ligiert, um einzelsträngige Matrizen für die anschließende qPCR-Amplifikation und -Detektion zu bilden [5]. Kürzlich wurde eine verbesserte Version der CLIP-PCR, die Multi-Section CLIP-PCR (mCLIP-PCR), entwickelt, die die Identifizierung von Plasmodium-Gattungen und -Arten mit einer deutlich verkürzten Testzeit ermöglicht [9].

Die Sonderregion Kachin II (KSR2), eine arme Bergregion im Norden Myanmars, hat eine gemeinsame Landgrenze von 214,6 km mit dem Landkreis Yingjiang in der Provinz Yunnan, China. Seit dem regionalen Konflikt in KSR2 im Jahr 2012 ist eine große Zahl von Binnenvertriebenen entlang der Grenze zwischen China und Myanmar eingewandert und hat sich dort neu angesiedelt, was ein Risiko für die Erfolge der gemeinsamen grenzüberschreitenden Malariapräventions- und -kontrollaktivitäten zwischen China (Provinz Yunnan) und Myanmar darstellt [10,11,12,13,14]. Im KSR2 von Myanmar stieg die Malariainzidenz von 2,1 % im Jahr 2012 auf 5,1 % im Jahr 2016 [15]. Darüber hinaus wurde 2016 ein Ausbruch von P. vivax in der Stadt Laiza und den umliegenden Gebieten beobachtet [16], wobei die Zahl der Malariafälle von 940 im Jahr 2015 auf 2080 im Jahr 2016 um das 2,3-fache anstieg [16]. Die Zahl der aus Myanmar in den Kreis Yingjiang importierten Malariafälle stieg rasch von 35 im Jahr 2012 [17] auf 185 im Jahr 2016 [16], was das Ziel der Malaria-Eliminierung im Kreis Yingjiang bis 2020 gefährdet [18,19,20].

In dieser Studie bewerteten die Autoren die Machbarkeit der Verwendung von CLIP-PCR in MSAT zur Bestimmung der Malariaprävalenz im Distrikt Laiza in Myanmar. Das Verständnis des Ausmaßes der Malariaprävalenz im Distrikt Laiza kann eine Grundlage für die Kontrolle des P. vivax-Ausbruchs und die Reduzierung des grenzüberschreitenden Malariaimports nach Yunnan, China, bilden.

Die Studie wurde von April bis Mai 2017 durchgeführt. Alle Gebiete des Bezirks Laiza im Umkreis von 2,5 km von der Grenze zu China wurden abgedeckt, einschließlich städtischer und vorstädtischer Regionen der Stadt Laiza, sechs umliegende Dörfer (Hpaw Gyung, Ja Htu Kawng, Mai Sak Pa, La Mai Yang, Mung Lai Hkyet und Mung Seng Yang), fünf entfernte Dörfer (Hpa Lap, Maga Yang, Na Ru, Pa Jau und Sha-It Yang), vier Lager für Binnenvertriebene (Dum Bung, Je Yang). Hka, Hpum Lum Yang und Woi Chyai), eine Schule und zwei Armeelager. Die Gesamtbevölkerung umfasste 23.169 Personen, die in Ziegelbetonbungalows in Laiza City, Holzziegelhäusern in Dörfern und provisorischen Schuppen aus Eisenblechen und Asbestfliesen in Binnenvertriebenenlagern lebten. Die Untersuchungsgebiete sind in Abb. 1 dargestellt.

Die Untersuchungsgebiete von MSAT für Malaria

Der Plasmodium falciparum (Pf)/Pan-LDH-Schnelltest (RDT) war das Produkt von Guangzhou Wondfo Biotechnology Co., Ltd., China (Charge W05460602WC). CLIP-PCR 2.0-Kits wurden von Diacurate Technology Co., China ([email protected]) gekauft, und mehrteilige CLIP-PCR (mCLIP-PCR)-Kits zur Identifizierung der Plasmodium-Gattung und -Art wurden vom Peking Union Medical College, Peking, gespendet . Die zugehörigen Sondensequenzen sind in der Zusatzdatei 1: Tabelle S1 aufgeführt. Ein berührungsloses Infrarot-Stirnthermometer von Omron (Modell MC-720) war das Produkt von Kunshan Reying Photoelectric Co., Ltd. (China), ein Echtzeit-Fluoreszenz-quantitatives PCR-Gerät (qPCR) (Modell CG-5) wurde von Kunshan Reying Photoelectric Co., Ltd. erworben Shanghai Likang Biomedical Technology Holding Co., Ltd. (China) und ein Schüttelinkubator (VorTemp 56) wurden von Labnet International (USA) bezogen.

In einem einzigen Raum von 20 m² im ersten Stock der Ambulanz der Gesundheitsklinik der Gemeinde Nabang (Kreis Yingjiang, China) wurde ein PCR-Labor eingerichtet. Entlang der drei Wände und in der Mitte des Raumes wurden mit Keramikfliesen belegte Arbeitsplatten positioniert. In der Nähe des vorderen Fensters am Eingang wurde ein einseitiger vertikaler Laminar-Flow-Biosicherheitsschrank für zwei Personen aufgestellt, und rechts neben dem Biosicherheitsschrank wurde ein Standardkühlschrank aufgestellt. Der Aufbau des PCR-Labors ist in Abb. 2 dargestellt.

Der Aufbau des PCR-Labors

Die Probenahme wurde von sieben geschulten Mitarbeitern des Gesundheitswesens durchgeführt, die die Zielgemeinde einen Tag vor dem Eingriff benachrichtigten. Am Probenahmetag (Tag 0) wurde eine kurze Gemeindeversammlung abgehalten, um die Einwilligungserklärung vorzulesen und Informationen über Malaria und die damit verbundenen Gesundheitsprobleme zu übermitteln. Einzelpersonen wurden zur freiwilligen Teilnahme eingeladen und unterzeichneten eine Einverständniserklärung. Nach der Registrierung des Bluttestformulars wurde die Körpertemperatur jedes Teilnehmers mit einem berührungslosen Infrarot-Stirnthermometer gemessen und zwei Blutflecken mit einer dreifach gefalteten Whatman 903-Probensammelkarte gesammelt. Die Blutflecken auf der geöffneten Trifold-Karte wurden kurz in einem belüfteten Raum getrocknet, indem die Karte 30–120 Minuten lang an einem Seil aufgehängt wurde. Anschließend wurden die Karten gefaltet und noch am selben Tag in einer speziellen Aufbewahrungsbox ins Labor gebracht. Wenn ein Teilnehmer innerhalb der letzten Woche eine Körpertemperatur von ≥ 37,8 °C hatte oder über Fieber in der Vorgeschichte berichtete, wurde zum Zeitpunkt der Blutentnahme ein Schnelltest (RDT) durchgeführt und im Falle eines positiven Ergebnisses ein Blutausstrich angefertigt.

Vier Techniker der Testgruppe legten die von der Probenahmegruppe gesammelten Blutfleckenproben zum Trocknen über Nacht auf die Laborarbeitsplatte. Am nächsten Tag (Tag 1) wurden aus einem Blutfleck jedes Teilnehmers zwei getrocknete, bluthaltige Scheiben mit einem Durchmesser von 3 Millimetern (mm) ausgestanzt und auf Plasmodium spp. untersucht. unter Verwendung von CLIP-PCR mit einer Matrix-Pooling-Strategie [5, 7]. Kurz gesagt, die Proben wurden in eine 10 × 10-Matrix gegeben. Eine Scheibe von jeder Probe in einer Rohprobe wurde gepoolt, und separat wurde eine Scheibe von jeder Probe in einer Säule gepoolt. Um eine mögliche Kreuzkontamination zu verhindern, wurde der Metalllocherkopf nach jedem Schlag in 70 %igen Alkohol getaucht und 3–5 Sekunden lang über einem Alkoholbrenner abgeflammt, abkühlen lassen und dreimal auf ein leeres Filterpapier gestanzt, bevor er das nächste Mal auf einem Locher verwendet wurde unterschiedlicher Blutfleck. Die gepoolten Scheiben wurden in ein 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen gegeben und mit 170 µl (µL) Lyselösung 30 Minuten lang unter Schütteln (1200 U/min) bei 56 °C inkubiert, um die Zellen zu lysieren. Anschließend wurden 100 µL in jede Vertiefung einer 96-Well-Einfangplatte überführt und 1 µL Sondenmischung zum Einfangen von 18 S-rRNA der Gattung Plasmodium hinzugefügt. Die Lösung wurde unter Schütteln (800 U/min) 120 Minuten lang bei 56 °C inkubiert, um das Ziel auf der Platte einzufangen. Nach dem Waschen der Platte wurden die an das Ziel gebundenen Nachweissonden 10 Minuten lang bei 37 °C ligiert, um eine Matrize für die anschließende qPCR-Amplifikation in derselben Vertiefung mit SYBR Green-Chemie zu bilden, wobei für die Gattungssonden spezifische Primer verwendet wurden. Bei positiven Rohpools und Säulenpools waren die „Schnittproben“ Kandidaten-Positive und wurden durch Analyse der einzelnen Proben ohne Pooling unter Verwendung von CLIP-PCR für Plasmodium spp. oder Plasmodium spp. weiter bestätigt. oder Plasmodium-Gattung und -Art (siehe unten), während andere für negativ erklärt wurden.

Während des gesamten Screenings wurde kultiviertes P. falciparum 3D7-Lysat als Kit-Positivkontrolle verwendet und nach dem Zufallsprinzip in die Platte gegeben; Als Negativkontrollen wurden mehrere No-Template-Kontrollen verwendet, die in Vertiefungen neben der Positivkontrolle platziert wurden. Als interne Kontrolle zur Validierung der CLIP-PCR wurden Blutausstriche von RDT-positiven Teilnehmern am Tag 0 zunächst durch Mikroskopie gemäß den Empfehlungen der WHO bestätigt [21, 22], die entsprechenden Blutflecken wurden nach dem Zufallsprinzip in die Gruppe aufgenommen Proben, die am selben Tag für nachfolgende CLIP-PCR-Tests von vier Technikern entnommen wurden, die keine Kenntnis von der Probenidentität hatten.

Die positiven Ergebnisse aus Gebieten, in denen in den letzten zwei Jahren P. falciparum gemeldet wurde, wurden zur Gattungs- und Artenbestimmung mittels mehrteiliger CLIP-PCR (mCLIP-PCR) analysiert [9]. Kurz gesagt wurde eine getrocknete Blutscheibe mit einem Durchmesser von 3 mm in ein 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen gegeben und zur Lyse mit 120 µl Lyselösung inkubiert. Anschließend wurden 100 µL in eine Vertiefung einer 96-Well-Einfangplatte überführt und mit 1 µL Sondenmischung versetzt, die sowohl Gattungs-Sondenmischung als auch Arten-Sondenmischung enthielt, um Plasmodium gattungsspezifisch, P. falciparum speziesspezifisch und P. falciparum einzufangen. vivax-speziesspezifische Abschnitte der 18 S-rRNA auf die Platte. Nach dem Waschen der Platte und einer 50-µL-Sonden-Ligationsreaktion wurde die Platte 1 Minute lang auf 90 °C erhitzt, um die ligierten Produkte freizusetzen, und 5 µL wurden zur Gattungsidentifizierung durch insgesamt durchgeführte qPCR in eine neue PCR-Plattenvertiefung übertragen Volumen von 25 µL/Well, das Primer enthält, die für die Gattungssonden spezifisch sind. Gattungspositive Proben wurden weiter auf Artenidentifizierung untersucht, indem weitere 5 µL in eine neue Vertiefung für qPCR überführt wurden, entweder mit Primern für die artenspezifischen Sonden von P. falciparum oder mit Primern für die artenspezifischen Sonden von P. vivax.

Am zweiten Tag wurden einem Kliniker, der für die Nachsorge der Teilnehmer verantwortlich war, positive CLIP-PCR- oder mCLIP-PCR-Ergebnisse vorgelegt. Bei diesen positiven Teilnehmern wurde eine zusätzliche RDT durchgeführt, um einige der positiven Ergebnisse zu bestätigen und um zu sehen, wie viele dieser positiven Ergebnisse unterhalb der Nachweisgrenze der RDT lagen. Unabhängig von den RDT-Ergebnissen wurde für jeden positiven Teilnehmer eine Behandlung gemäß den Empfehlungen der WHO eingeleitet.

Die Datenbank wurde mit Microsoft Excel 2010 erstellt und mithilfe deskriptiver Statistiken (SPSS Statistics Version 20) analysiert. Die tägliche Testkapazität wurde als Anzahl der CLIP-PCR-gescreenten Teilnehmer pro Tag ausgedrückt. Die Screening-Kosten pro Person wurden als tatsächlicher Kaufpreis der CLIP-PCR-Reagenzien dividiert durch die Anzahl der gescreenten Teilnehmer ermittelt. Die mittels CLIP-PCR ermittelte Parasitenprävalenzrate (%) wurde als Anzahl der positiven Ergebnisse dividiert durch die Gesamtzahl der untersuchten Teilnehmer berechnet. Bei der RDT-Bestätigung der PCR-Ergebnisse wurden die Proben als mikroskopisch betrachtet, wenn die RDT-Ergebnisse positiv waren, und als submikroskopisch, wenn die RDT-Ergebnisse negativ waren. Der Prozentsatz submikroskopischer Infektionen wurde im Verhältnis zur Anzahl positiver Proben berechnet.

Vom 26. April bis 23. Mai 2017 wurden insgesamt 15.038 Teilnehmer befragt, mit einer Bevölkerungsabdeckungsrate von 64,91 % (15.0381/23.169). Es gab 7260 Männer und 7778 Frauen; Das Durchschnittsalter der Teilnehmer betrug 24,34 ± 17,66 Jahre (Bereich: 0,5–93 Jahre). Am Tag 0 wurden insgesamt 118 Personen von den RDTs getestet. Von ihnen hatten 75 vor Ort Fieber (Körpertemperatur ≥ 37,8 °C) und 43 hatten innerhalb einer Woche Fieber in der Vorgeschichte, und 9 der 118 wurden als RDT-positiv befunden. Von ihnen wurden 8 am ersten Tag mikroskopisch positiv auf P. vivax und 1 auf P. falciparum getestet.

Unter den 15.038 Blutproben wurden mit CLIP-PCR-Kits für 35 Platten insgesamt 204 positive Proben identifiziert. Die PCR-basierte Parasitenprävalenzrate betrug 1,36 % (204/15.038), die Testkapazität betrug 537 Proben/Tag (15.038/28) und die Screening-Kosten lagen bei etwa 0,92 US-Dollar pro Person (13.835 US-Dollar/15.038). Die 9 RDT-positiven Proben wurden durch CLIP-PCR bestätigt. Die Sensitivität und Spezifität der CLIP-PCR im Vergleich zur Mikroskopie betrugen jeweils 100 %.

In den meisten untersuchten Gebieten dieser Studie wurde in den letzten zwei Jahren nur P. vivax gemeldet, und daher wurden individuell bestätigte CLIP-PCR-positive Proben aus diesen Gebieten ohne weitere Tests als P. vivax-Infektionen betrachtet. Die 53 CLIP-PCR-positiven Proben aus Gebieten, in denen in den vergangenen zwei Jahren P. falciparum gemeldet wurde, wurden mittels mehrteiliger CLIP-PCR (mCLIP-PCR) auf Gattungs- und Artbestimmung analysiert. Unter ihnen wurden 53 durch mCLIP-PCR auf Gattungsebene als positiv bestätigt, mit einer Übereinstimmungsrate von 100 % im Vergleich zur CLIP-PCR. Die Artidentifizierung mit mCLIP-PCR betrug 35 P. vivax, 14 P. falciparum, 2 P. vivax/P. Falciparum-Mix und 2 Negativ. Die 9 RDT-positiven Proben wurden auf Artenebene durch mCLIP-PCR mit den gleichen Ergebnissen wie die Mikroskopie identifiziert.

Am zweiten Tag erhielten alle 204 CLIP-PCR-positiven Teilnehmer eine RDT-Bestätigung. Unter ihnen waren 132 von 204 RDT-negativ und wurden als submikroskopisch oder subpatent angesehen, was zu einer submikroskopischen Infektionsrate von 64,71 % führte (132/204). Von den 72 RDT-Positiven waren 9 bestätigt P. falciparum oder gemischte Arten positiv und 63 waren P. vivax- oder andere Nicht-P. Falciparum positiv (Tabelle 1). Die Ergebnisse der Artenidentifizierung mit mCLIP-PCR und RDT sind in Tabelle 2 dargestellt.

Die 204 mit CLIP-PCR positiv gescreenten Patienten erhielten eine Behandlung, darunter 188, 14 und 2 als P. vivax, P. falciparum bzw. gemischte P. falciparum + P. vivax. Der Anteil der mit P. vivax infizierten Teilnehmer betrug 92,2 % und das Verhältnis von P. falciparum zu P. vivax-Infektion betrug 0,09. Die geografische Verteilung von Malaria ist in Tabelle 3 zusammengefasst. Der MSAT-Screening-Workflow in dieser Studie ist in Abb. 3 dargestellt.

Das Flussdiagramm des Screenings. (1) Die Fettschrift in den Klammern gab die Ergebnisse an. (2) DBS: Getrocknete Blutflecken. (3) RDT: Schnelldiagnosetest. (4) Pv P. vivax. (5) Pf P. falciparum.

Seit der Erfindung der PCR konzentrierten sich die meisten molekulardiagnostischen Innovationen jahrzehntelang ausschließlich auf Amplifikation und Detektion zur Verbesserung der Empfindlichkeit und Spezifität, aber nur wenige konzentrierten sich auf präanalytische Prozesse, um die Komplexität molekularer Tests zu reduzieren, was das eigentliche Hindernis für ihre weit verbreiteten Anwendungen darstellt. CLIP-PCR ähnelt konzeptionell dem ELISA, wobei die Einfangsonde und die Nachweissonde dem Einfangantikörper und dem Nachweisantikörper analog sind. Bei der anschließenden PCR-Amplifikation handelt es sich um eine Signalamplifikation (und nicht um eine Zielamplifikation), analog zur enzymatischen Kaskade zur Signaldetektion im ELISA. Darüber hinaus bietet der Ligationsschritt bei der CLIP-PCR zwei wichtige Vorteile, die ELISA nicht bieten kann: (1) deutlich bessere Spezifität und reduzierter Hintergrund, da einzelne Sonden kein Signal erzeugen; und (2) die Fähigkeit, Kontaminationen deutlich zu vermeiden, da nur die ligierten Sonden nachgewiesen werden. Die reduzierte Komplexität der CLIP-PCR ermöglicht ein Hochdurchsatz- und empfindliches molekulares Screening.

Kontamination, hohe Kosten im Zusammenhang mit langwierigen Verfahren und geringer Durchsatz sind einige der Herausforderungen beim PCR-basierten Nachweis. Daher verlangt die WHO, dass ein Labor, das PCR-Analysen zu diagnostischen Zwecken durchführt, in mindestens drei physisch getrennte Abteilungen für die Reagenzienvorbereitung, Probenvorbereitung sowie Amplifikation und Produktdetektion unterteilt ist [22, 23]. In dieser Studie wurde die CLIP-PCR erfolgreich in einem Raum durchgeführt, der nur über einen Biosicherheitsschrank, einen Kühlschrank, einen Desktop-Schüttelinkubator (Shaker) und ein qPCR-Gerät verfügte (Abb. 2), was darauf hindeutet, dass es möglich ist, eine CLIP-PCR durchzuführen. basierte Diagnostik unabhängig von der Aufteilung des Laborraums, vorausgesetzt, dass Standardmaßnahmen zur Verhinderung einer Kontamination eingehalten werden. Beispielsweise wurden Standardvorkehrungen getroffen, um eine Kreuzkontamination bei der Probenahme zu verhindern (z. B. durch die Verwendung von dreifach gefalteten Probenahmekarten und das Abflammen des Locherkopfes nach jedem Locher). Bei der CLIP-PCR wird der Großteil der Ziel-RNA am Boden der Vertiefung und nicht in der Lösung eingefangen, wodurch sie weniger anfällig für aerosolbedingte Kreuzkontaminationen ist. Ungebundene, kreuzkontaminierende Ziel-RNA kann keine Signalquelle sein, da vor allem nicht die Ziel-RNA amplifiziert wird, sondern die ligierten gebundenen Sonden, die unten gebunden bleiben. Die Amplifikationsvorlage bildet sich erst, nachdem der Ligationsschritt die gebundenen Sonden direkt vor der Amplifikation ligiert hat. Diese Merkmale machen CLIP-PCR weniger anfällig für Kreuzkontaminationen und eignen sich für den Betrieb in einem Multi-Well-Plattenformat, selbst in einem anderen Raum als dem dedizierten PCR-Reinraum. Diese Studie zeigte auch, dass ein CLIP-PCR-Laboraufbau unter Umgehung der Nukleinsäureextraktion dazu beitragen würde, die Herausforderungen einer rechtzeitigen PCR-Diagnose und einer sofortigen Behandlung zu lösen [2, 24, 25], mit einer Lösung für MSAT bei Malaria: Probenahme am Tag 0, PCR-Screening am ersten Tag und die Behandlung am zweiten Tag. In dieser Studie betrug die CLIP-PCR-Testkapazität 538 Personen/Tag und die Screening-Kosten betrugen nur 0,92 US-Dollar/Person. Obwohl berichtet wurde, dass der CLIP-PCR-Nachweis durch das Poolen von bis zu 36 Proben/Well [5] durchgeführt werden kann und dass die Kosten pro Probe mit zunehmender Anzahl gepoolter Proben noch weiter sinken [7], ist die Matrix-Pooling-Strategie Beim Hochdurchsatz-Screening ist die Konzentration des Laborpersonals erforderlich, und die Möglichkeit einer falschen Probenhandhabung steigt mit der Anzahl der Probenpools. Daher entschied sich diese Studie für eine 10 × 10-Matrix-Pooling-Strategie mit einem doppelten Überprüfungsmechanismus, der dem Matrix-Pooling-Ansatz innewohnt, um mögliche Fehler zu minimieren (d. h. bei jeder positiven Probe sollten sowohl der Rohpool als auch der Spaltenpool positiv sein. Wenn nicht, etwas stimmt nicht). Die Screening-Kapazität war auf < 600 Personen/Tag pro qPCR-Maschine begrenzt, basierend auf der Probensammelgeschwindigkeit und der Verarbeitungskapazität des Schüttlers und der PCR-Maschine.

Im Vergleich zur „normalen“ PCR mit Pooling [26, 27], die ein weiteres effizientes und valides Mittel für groß angelegte Malaria-Screenings darstellt, hat die CLIP-PCR mit Pooling die folgenden wichtigen Vorteile: (1) Es ist daher keine Nukleinsäureextraktion erforderlich eignet sich besser für die Verarbeitung mit hohem Durchsatz und ist viel weniger beunruhigt über die Kontamination der Probe oder den Abbau von Nukleinsäuren während oder nach der Extraktion; Es ist auch viel kostengünstiger als die Verwendung automatisierter DNA/RNA-Extraktionsgeräte. (2) Mit dem CLIP-PCR-Assay können gepoolte DBS-Proben ohne Empfindlichkeitsverlust getestet werden [5], da alle Hintergrund-RNAs der negativen Proben weggewaschen werden, ohne die anschließende Amplifikation zu beeinträchtigen. Im Gegensatz dazu kann bei der Standard-PCR mit Pooling entweder die Extraktions- oder die Amplifikationseffizienz in gepoolten Proben beeinträchtigt werden, wenn störende Hintergrundnukleinsäuren in negativen Proben hinzugefügt wurden. (3) CLIP-PCR ist weniger anfällig für Kreuzkontaminationen als gewöhnliche PCR. Für die CLIP-PCR ist jedoch ein qPCR-Gerät erforderlich, was für Labore in Ländern mit begrenzten Ressourcen zu kostspielig sein kann. Eine ähnliche Strategie mit LAMP [28] kann die Gesamtkosten für die Einrichtung senken.

Die Leistung von CLIP-PCR, Nested-PCR und quantitativer Reverse-Transkription-PCR (qRT-PCR) wurde von Zhao et al. bewertet. bei der Untersuchung von 1.005 Einzelproben, die 2015 in Laiza City und Umgebung gesammelt wurden [29]. Der Autor behauptete, die Empfindlichkeit der CLIP-PCR sei deutlich geringer als bei den anderen molekularen Methoden [29], im Gegensatz zu ähnlichen Feldvergleichen aus demselben berichteten Bereich [7,8,9]. Ein wichtiger Fehler bei Zhao et al. [29] Als Vergleichsstudie wurde die CLIP-PCR nur unter Verwendung von Trockenblutproben (DBS) mit unbekannter Qualität ausgewertet, während die verschachtelte PCR und die qRT-PCR alle nur mit frischen Blutproben ausgewertet wurden [29]. Es wurde kein Versuch unternommen, die verschachtelte PCR und die qRT-PCR unter Verwendung derselben DBS-Proben zu bewerten, während Zhao et al. bei der Bewertung der CLIP-PCR unter Verwendung von Standardblutproben die gleiche hohe Empfindlichkeit von 0,01 Parasiten/µL wie bei den anderen molekularen Methoden beobachteten . [29]. Daher ist die Schlussfolgerung von Zhao et al. [29] bleibt fraglich. Bei einem aktuellen Screening von 4.580 asymptomatischen DBS-Proben zeigte ein direkter Vergleich des CLIP-PCR-Genus-Assays mit der Standard-qPCR an einer Teilmenge von 100 asymptomatischen DBS-Proben eine 100-prozentige Übereinstimmung zwischen den beiden Methoden mit hoher Korrelation (R2 = 0,81). ) zwischen Cq-Werten der beiden Methoden [9].

Da sowohl CLIP-PCR als auch mCLIP-PCR ursprünglich mit Standard-qPCR unter Verwendung von getrockneten Blutflecken validiert wurden [5, 9] und da die meisten Standard-PCR-Ansätze anspruchsvolle Laborbedingungen erfordern und nicht für Hochdurchsatz-Screening geeignet sind [24], Diese Studie verifizierte CLIP-PCR-Ergebnisse nicht mehr mit anderen PCR-Protokollen im Feldlabor. Stattdessen wurde eine Qualitätskontrolle mit No-Template-Kontrollen, Kit-Positivkontrollen (kultivierte P. falciparum 3D7-Lysate) sowie 9 RDT-positiven Proben, die am Tag 0 in derselben Population identifiziert wurden, verwendet. Zu den RDT-Positiven gehörten 8 durch Mikroskopie bestätigte positive P. vivax und 1 durch Mikroskopie bestätigte positive P. falciparum. Das Blindscreening mit CLIP-PCR ergab 100 % Positivität, und mCLIP-PCR identifizierte die erwarteten Arten.

Wie in Tabelle 3 gezeigt, war die Malariaprävalenz laut PCR-Ergebnissen im Dorf Sha-it Yang am höchsten (19,10 %), was auf seine Lage zurückzuführen ist. Das Dorf Sha-it Yang liegt weit entfernt von der Stadt Laiza (Abb. 1) in einem abgelegenen Tal in der Nähe des Waldes, wo ein ethnisches Armeelager errichtet wurde, was auf ein hohes Risiko der Malariaübertragung unter Bedingungen hinweist, in denen medizinische Versorgung nicht leicht zugänglich war [ 30]. Die Studienergebnisse zeigten auch, dass Malaria hauptsächlich in der Stadt Laiza und den umliegenden Gebieten festgestellt wurde, wobei die Prävalenz in der Stadt am höchsten war, während in entfernten Gebieten keine Fälle festgestellt wurden. Ein Grund für diese Verteilung der Fälle könnte sein, dass Laiza City in einem heißen, niedrig gelegenen, dicht besiedelten Gebiet liegt, in dem die Malariaübertragung ganzjährig mit einem saisonalen Höhepunkt erfolgt, während in den entfernteren hochgelegenen Gebieten (mit Ausnahme von Sha-it Yang Village) ist die Übertragung in der kalten Jahreszeit unterbrochen [16]. Ein weiterer Grund ist, dass diese Studie Ende April 2017 begann – dem frühen Stadium des Höhepunkts der Malaria-Epidemie in Laiza City, wo es 2016 zum Ausbruch von P. vivax kam [16]; Daher könnte es während des Studienzeitraums in Laiza City eine große Anzahl asymptomatischer Träger und neu infizierter Personen geben. Diese Studie zeigte, dass die gesamte PCR-basierte Parasitenprävalenzrate in der analysierten Population 1,36 % betrug und dass P. falciparum/P. Das Vivax-Verhältnis lag bei 0,09, was auf ein sehr niedriges Übertragungsgebiet gemäß der WHO-Kategorisierung hinweist [31]. Der Anteil der Subpatent-Infektionen betrug 64,7 %, was der von Moreira et al. berichteten 67 %-Rate der submikroskopischen P. vivax-Infektion ähnelte. [32] und Cheng et al. [33], was auf ein sehr großes potenziell infektiöses Parasitenreservoir im Untersuchungsgebiet hinweist.

Diese Studie weist einige Einschränkungen auf. Lediglich 64,9 % der Zielgruppe wurden durch das Screening erfasst. Obwohl das Probenahmeteam die Zielgemeinde einen Tag im Voraus informierte, weigerten sich einige Bewohner, sich freiwillig zu melden, während andere nicht rechtzeitig kommen konnten, insbesondere diejenigen, die häufig im Wald arbeiten und daher einem hohen Risiko ausgesetzt sind. Dies könnte zu einer Stichprobenverzerrung geführt haben. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass MSAT eine effiziente Logistikunterstützung benötigt. Darüber hinaus wurde das PCR-Labor aus Gründen der Sicherheit, der Unterbringung der Forscher und der insgesamt besseren Bedingungen als im Untersuchungsgebiet Myanmar auf der chinesischen Seite der Grenze eingerichtet. Obwohl das Labor von einigen Sammelstellen nur 200 m entfernt war, befand es sich nicht direkt im Feld. Schließlich wurde die Rate submikroskopischer Infektionen auf der Grundlage von RDT-Ergebnissen und nicht auf der Grundlage einer mikroskopischen Analyse berechnet; die tatsächliche Zahl kann niedriger sein.

Eine Strategie, CLIP-PCR in MSAT für niedrige Übertragungseinstellungen einzubeziehen, bietet die Vorteile einer verbesserten diagnostischen Empfindlichkeit, eines hohen Durchsatzes, einer Gesamtkosteneffizienz und einer zeitnahen Diagnose und Behandlung. All diese Faktoren können potenzielle Verbesserungen bei der Durchführung von MSAT in Gebieten mit geringer Übertragungsrate darstellen, um die Bemühungen zur Malariabekämpfung in der GMS-Region zu unterstützen.

Die während der aktuellen Studie verwendeten und/oder analysierten Datensätze sind auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.

Capture- und Ligationssonden-PCR

Sonderregion Kachin II

Mehrteilige Capture- und Ligation-Sonden-PCR

Massenuntersuchung und -behandlung

Polymerase Kettenreaktion

Quantitative Echtzeit-Fluoreszenz-PCR

Schneller Diagnosetest

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Referenzen herunterladen

Wir danken der Gesundheits- und Armutsbekämpfungsabteilung der Sonderregion Kachin II aufrichtig für die Bereitstellung von Personal. Ihre Teilnahme ist der Grundstein für den Erfolg dieser Studie. Wir danken dem Nabang Township Health Center für die Bereitstellung von Laborräumen, Logistik und Personal.

Das Design, die Implementierung, die Analyse, die Interpretation der Daten und das Verfassen des Manuskripts der Studie wurden von der National Natural Science Foundation of China (81960374) unterstützt, die Technologie und die Kits der mCLIP-PCR in der Studie wurden von National Major Science and Technology unterstützt Projekte (2018ZX10101001) und vom Overseas Expertise Introduction Center for Discipline Innovation („111 Center“) (BP 0820029) an ZZ

Xiao-dong Sun, Ya-ling Zhao und Zu-rui Lin haben gleichermaßen zu dieser Arbeit beigetragen

Yunnan Institute of Parasitic Diseases, Yunnan Provincial Collaborative Innovation Center for Public Health and Disease Prevention and Control, Yunnan Provincial Key Laboratory of Vector-borne Diseases Control and Research, Yunnan Provincial Center of Malaria Research, Puer, 665000, China

Xiao-dong Sun, Zu-rui Lin, Yao-wu Zhou, Peng Tian, ​​​​Kai-xia Duan, Chun-li Ding und Qi-yan Chen

Institut für medizinische Grundlagenwissenschaften, Chinesische Akademie der medizinischen Wissenschaften; School of Basic Medicine, Peking Union Medical College, Peking, 100005, China

Ya-ling Zhao, Ye Zhao und Zhi Zheng

Yingjiang Center for Disease Control and Prevention, Yingjiang, 679300, China

Shi-gang Li & Xiang-rui Guo

Brown School, Washington University, St. Louis, MO, USA

Yuan Sui & Duo-quan Wang

WHO-Kooperationszentrum für Tropenkrankheiten, Nationales Zentrum für internationale Forschung zu Tropenkrankheiten, Schlüssellabor für Parasiten- und Vektorbiologie, Ministerium für Wissenschaft und Technologie, Gesundheitsministerium, Nationales Institut für Parasitenkrankheiten, Chinesisches Zentrum für Krankheitskontrolle und Prävention, Chinesisches Zentrum für Tropenkrankheitsforschung, Shanghai, 200025, China

Shen-ning Lu

Malaria Elimination Initiative, Institut für globale Gesundheitswissenschaften, University of California, San Francisco, CA, USA

Chris Cotter

Abteilung für Frauen- und Kindergesundheit, Universität Uppsala, Uppsala, Schweden

Chris Cotter

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XD S und ZZ haben dieses Projekt konzipiert und gestaltet. XD S und ZR L organisierten und überwachten die Felddurchführung, XD S, YL Z, YZ, CL D, ZR L, SG L, XR G, PT, KX D, SN L, YS und QY C führten die Feldarbeit durch, sammelten und sammelten interpretierte Daten. XD S und ZZ haben den Manuskriptentwurf geschrieben und XD S hat die Abbildungen vorbereitet. 1 und 2 sowie ZZ, DQ W, CC und YS überarbeiteten das Manuskript. Alle Autoren haben das Manuskript überprüft. Alle Autoren haben das endgültige Manuskript gelesen und genehmigt.

Korrespondenz mit Duo-quan Wang oder Zhi Zheng.

Das Yunnan Institute of Parasitic Disease (YIPD, China) und das Gesundheitsamt der KS2 von Myanmar genehmigten das Studienprotokoll. Die Ethikkommission des YIPD genehmigte die Studie [Referenznummer: YIPD-EC-2017(4)]. Alle Teilnehmer wurden in einer kurzen Besprechung in ihrer Muttersprache informiert. Einzelpersonen nahmen freiwillig teil und unterzeichneten die Einverständniserklärung vor der Blutentnahme rechtsgültig. Bei Kindern unter 12 Jahren wurde vor der Blutentnahme die Einwilligung der Eltern oder des Erziehungsberechtigten unterzeichnet. In diesem Artikel gab es keine persönlichen Identifikationsdaten des Teilnehmers.

Unzutreffend.

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden Interessen haben.

Springer Nature bleibt neutral hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten.

Sondensequenzen.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht gesetzlich zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/. Der Creative Commons Public Domain Dedication-Verzicht (http://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/) gilt für die in diesem Artikel zur Verfügung gestellten Daten, sofern in einer Quellenangabe für die Daten nichts anderes angegeben ist.

Nachdrucke und Genehmigungen

Sun, Xd., Zhao, Yl., Lin, Zr. et al. Implementierung einer neuartigen Capture- und Ligation-Sonden-PCR-Methode im Massenscreening und in der Behandlung, um die Bemühungen zur Malaria-Eliminierung in der Grenzregion China-Myanmar zu unterstützen. Malar J 22, 21 (2023). https://doi.org/10.1186/s12936-023-04449-x

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Eingegangen: 30. Juni 2022

Angenommen: 07. Januar 2023

Veröffentlicht: 19. Januar 2023

DOI: https://doi.org/10.1186/s12936-023-04449-x

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